पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) क्या है? परीक्षण, कदम और के लिए इस्तेमाल पर तथ्य

पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) क्या है?

पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक ऐसी तकनीक है जिसका उपयोग डीएनए की ट्रेस मात्रा (और कुछ उदाहरणों में, आरएनए) को लगभग किसी भी तरल या सतह पर स्थित करने के लिए किया जाता है जहां डीएनए किस्में जमा हो सकती हैं। पीसीआर को समझने की कुंजी यह जानना है कि प्रत्येक मानव, पशु, पौधे, परजीवी, जीवाणु या वायरस में आनुवंशिक सामग्री जैसे डीएनए (या आरएनए) अनुक्रम (न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम या डीएनए या आरएनए के टुकड़े) होते हैं जो उनकी प्रजातियों के लिए अद्वितीय हैं। और उस प्रजाति के व्यक्तिगत सदस्य के लिए। नतीजतन, अगर एक नमूने में डीएनए या आरएनए के खंड होते हैं, तो पीसीआर एक विधि है जिसका उपयोग इन अद्वितीय अनुक्रमों को प्रवर्धित (कई अधिक समान प्रतियां बनाने के लिए) किया जाता है, ताकि उनका उपयोग स्रोत की पहचान के लिए बहुत अधिक संभावना के साथ किया जा सके ( ट्रेस डीएनए या आरएनए के विशिष्ट व्यक्ति, जानवर, या रोगजनक जीव) सामग्री के लगभग किसी भी नमूने में या उस पर पाया जाता है।

पीसीआर प्रवर्धन पहचान परीक्षण का केवल एक हिस्सा है, हालाँकि। एक बार प्रवर्धन हो जाने के बाद (नीचे देखें), प्रवर्धित खण्डों की तुलना किसी ज्ञात स्रोत से अन्य न्यूक्लियोटाइड खंडों (उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट व्यक्ति, पशु या रोगजनक जीव) से की जानी चाहिए। अद्वितीय खंडों की यह तुलना अक्सर मनुष्यों, रोगजनकों या अन्य स्रोतों से ज्ञात न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों के बगल में पीसीआर-जनित न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों को एक अलग जेल में रखकर की जाती है। विद्युत प्रवाह को जेल के माध्यम से चलाया जाता है और विभिन्न न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम रूप बैंड होते हैं जो उनके विद्युत आवेश और आणविक आकार के अनुसार "सीढ़ी" से मिलते-जुलते हैं। इसे जेल वैद्युतकणसंचलन कहा जाता है। बैंड या "सीढ़ी" जैसे कदम जो कि जेल में समान स्तर पर स्थानांतरित होते हैं, न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों की पहचान दिखाते हैं। यह विधि सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक है जो पीसीआर परीक्षण पूरा होता है (चित्र 1 देखें)।

चित्रा 1, बैंड या "सीढ़ी" पीसीआर के चरणों की तरह माइकोबैक्टीरियम (सीडीसी के सौजन्य) का उत्पादन किया

चित्रा। दोहराए जाने वाले तत्व (रेप) -PCR (A) और पल्स-फील्ड जेल वैद्युतकणसंचलन (PFGE) (B) माइकोबैक्टीरियम कॉस्मेटिक के पैटर्न ओहियो में 2 और वेनेजुएला में 1 मरीज से अलग हैं। रेप-पीसीआर को BOXA1R प्राइमर (3) का उपयोग करके किया गया था, और PFGE को प्रतिबंध एंजाइम एसीआई के साथ प्रदर्शन किया गया था। लेन 1, 2, ओहियो OH1 और OH2 को अलग करता है; लेन 3, 4, नियंत्रण उपभेदों ATCC BAA-878T और ATCC BAA-879; लेन 5, वेनेजुएला VZ1 को अलग करता है। डीएनए आकार मानक 100-बीपी (एस 1) और 48.5-केबी मार्कर (एस 2) हैं।

पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) कैसे किया जाता है?

1983 में, कैरी मुलिस ने डीएनए अनुक्रम को बढ़ाने के लिए बुनियादी कदमों का पता लगाया। उन्हें और माइकल स्मिथ को 1993 में इस प्रक्रिया को विकसित करने के लिए नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया था। कुछ बुनियादी कदम हैं जिनका क्रम में पालन किया जाता है; पीसीआर एक ट्यूब में उपयुक्त रसायनों और एक विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए हीटर के साथ किया जा सकता है। आवश्यक अभिकर्मकों या रसायनों इस प्रकार हैं:

• एक नमूना जिसमें एक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम होता है (रक्त, बाल, मवाद, त्वचा के छिलने आदि से)
• डीएनए प्राइमर्स: शॉर्ट सिंगल-फंसे डीएनए जो न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों से जुड़ता है जो न्यूक्लियोटाइड्स के पूरक स्ट्रैंड के संश्लेषण को बढ़ावा देता है
• डीएनए पोलीमरेज़: एक एंजाइम, जब डीएनए का एक प्राइमर बाध्य होता है, पूरक आधार जोड़े बनाने के लिए डीएनए निर्माण ब्लॉकों को संलग्न करने वाले डीएनए खंड को नीचे जाता है और इस तरह डीएनए के एक पूरक न्यूक्लियोटाइड स्ट्रैंड को संश्लेषित करता है (गर्मी प्रतिरोधी डीएनए पोलीमरेज़, टैक का परिचय)। पोलीमरेज़, गर्मी प्रतिरोधी बैक्टीरिया से प्राप्त, स्पष्ट रूप से पीसीआर प्रदर्शन करने की क्षमता में सुधार)
• डीएनए बिल्डिंग ब्लॉक्स की एक बड़ी मात्रा ने न्यूक्लियोटाइड्स (एडेनिन, थाइमिडीन, साइटोसिन और ग्वानिन, जिसे संक्षिप्त रूप में कहा जाता है: A, T, C, और G, क्रमशः) समाधान में मौजूद हैं। जब इन ब्लॉकों को एक साथ जोड़ा जाता है, तो वे एक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम या डीएनए का एक एकल किनारा बनाते हैं। जब ये बिल्डिंग ब्लॉक कमजोर हाइड्रोजन बॉन्ड्स द्वारा अपने पूरक बिल्डिंग ब्लॉक को बांधते हैं (उदाहरण के लिए, ए केवल टी और जी के साथ केवल सी के साथ बांड होगा) एक पूरक डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम बनता है और मूल एकल-फंसे डीएनए के लिए बाध्य होता है। जब बंधन पूरा हो जाता है, तो एक विशिष्ट क्रम में एक पूरक डबल स्ट्रैंड डीएनए बनता है।

पीसीआर, तब डीएनए के एक खंड के नमूने से शुरू होता है, जिसे ऊपर सूचीबद्ध अभिकर्मकों के साथ एक ट्यूब में रखा गया है। समाधान को कम से कम 94 सी (201.2 एफ) तक गरम किया जाता है; यह ऊष्मा हाइड्रोजन बंधों को तोड़ती है जो पूरक डीएनए किस्में बनाने की अनुमति देते हैं, इसलिए मिश्रण में केवल एक ही किस्में मौजूद होती हैं (इसे दोहरे फंसे डीएनए का विकृतीकरण कहा जाता है)।

मिश्रण को लगभग 54 सी (129.2 एफ) तक ठंडा करने की अनुमति है। इस तापमान पर, डीएनए प्राइमर और डीएनए पोलीमरेज़ व्यक्तिगत एकल-फंसे हुए डीएनए से जुड़ते हैं (इसे डीएनए की annealing कहा जाता है)। क्योंकि बिल्डिंग ब्लॉक मिश्रण में अधिक (उच्च सांद्रता) में हैं, पॉलीमरेज़ उन्हें डीएनए के नए पूरक किस्में (डीएनए का विस्तारित विस्तार) बनाने के लिए उपयोग करता है और यह प्रक्रिया 72 सी (161.6 एफ) पर अधिक तेजी से होती है। यह प्रक्रिया मूल अणु के प्रत्येक एकल स्ट्रैंड से एक नया डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए अणु बनाता है।

इस चक्र को एक थर्मल साइक्लर कहे जाने वाले मशीन में लगभग 40 बार दोहराया जाता है जो स्वचालित रूप से हीटिंग-कूलिंग चक्र को दोहराता है, प्रत्येक डीएनए अनुक्रम की मात्रा के साथ हर बार हीटिंग-कूलिंग चक्र पूरा होता है। शुरू में डीएनए का एक ही छोटा खंड 40 दोहरीकरण चक्रों के बाद लगभग 100 बिलियन प्रतियों तक बढ़ाया जा सकता था।

डॉक्टर पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) टेस्ट का आदेश क्यों देंगे?

पीसीआर परीक्षण कई परीक्षणों का आधार बनता है जो कई अलग-अलग चिकित्सा सवालों के जवाब दे सकते हैं जो चिकित्सकों को रोगियों के निदान और उपचार में मदद करते हैं। उदाहरण के लिए, पीसीआर परीक्षण रोगियों में रोगजनक जीवों का पता लगा सकते हैं और पहचान सकते हैं, विशेष रूप से उन लोगों को जो खेती करना मुश्किल है (उदाहरण के लिए, एचआईवी और अन्य वायरस और कुछ कवक)।

अन्य डॉक्टर आनुवांशिक बीमारियों का निदान करने में मदद करने के लिए पीसीआर परीक्षणों का आदेश देते हैं, जबकि अन्य डॉक्टर पीसीआर का उपयोग जैविक संबंधों जैसे बच्चों के माता-पिता की पहचान करने में करते हैं। पीसीआर परीक्षणों का उपयोग कुछ कैंसर में पाए जाने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्तन और पुनर्व्यवस्था की पहचान और लक्षण वर्णन करने के लिए भी किया जाता है।

हालाँकि, पीसीआर परीक्षणों को वैज्ञानिक जांच के कई पहलुओं में संशोधित और विस्तारित किया गया है, जिसमें विकासवादी जीव विज्ञान, आनुवांशिक फिंगरप्रिंटिंग, फोरेंसिक जांच और कई अन्य शामिल हैं।

RT-PCR क्या है?

आरटी-पीसीआर एक पीसीआर परीक्षण है जिसे आरएनए का पता लगाने और मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि प्रारंभिक पीसीआर परीक्षण प्रवर्धित डीएनए, कई वायरस और अन्य जैविक घटक (उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया) आरएनए को उनके आनुवंशिक पदार्थ के रूप में उपयोग करते हैं। आरटी-पीसीआर पहले आरएनए लेकर पारंपरिक पीसीआर से भिन्न होता है और आरएनए स्ट्रैंड को डीएनए स्ट्रैंड में परिवर्तित करता है। यह मूल रूप से डीएनए पोलीमरेज़ के बजाय एक एंजाइम टर्मिस्ड रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करने के अपवाद के साथ ऊपर वर्णित पीसीआर के लिए एक ही विधि द्वारा किया जाता है। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस आरएनए के एकल स्ट्रैंड को डीएनए के पूरक स्ट्रैंड में अनुवादित करने की अनुमति देता है। एक बार जब यह प्रतिक्रिया होती है, तो डीएनए को बढ़ाने के लिए नियमित पीसीआर विधि का उपयोग किया जा सकता है। कई आरएनए वायरस का पता लगाने और उनका अध्ययन करने के लिए आरटी-पीसीआर का उपयोग किया गया है।

आरटी-पीसीआर को पीसीआर की एक और विविधता के साथ भ्रमित नहीं किया जाना चाहिए, जिसे रीयल-टाइम पीसीआर कहा जाता है। रियल-टाइम पीसीआर पीसीआर की एक भिन्नता है जो प्रक्रिया के सामान्य 40 चक्रों के दौरान प्रवर्धित डीएनए के विश्लेषण की अनुमति देता है। यद्यपि यह प्रक्रिया साइकिल चलाने के साथ पारंपरिक पीसीआर के समान है, रियल-टाइम पीसीआर कुछ बिल्डिंग ब्लॉकों या छोटे न्यूक्लियोटाइड स्ट्रैंड्स से जुड़े फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करता है। प्रयुक्त विधि के आधार पर, प्रतिदीप्ति तब होती है जब प्रवर्धित डीएनए किस्में बनती हैं। प्रतिदीप्ति की मात्रा को 40 चक्रों में मापा जा सकता है और जांचकर्ताओं को प्रवर्धन चक्रों के दौरान विशिष्ट उत्पादों और उनकी मात्रा को मापने की अनुमति देता है। यह अक्सर जांचकर्ताओं या लैब तकनीशियनों को पीसीआर उत्पादों के विश्लेषण के लिए आवश्यक जेल वैद्युतकणसंचलन या अन्य माध्यमिक प्रक्रियाओं को छोड़ने की अनुमति देता है, इस प्रकार अधिक तेजी से परिणाम उत्पन्न करता है।

वास्तविक समय पीसीआर और आरटी-पीसीआर मूल पीसीआर परीक्षण के रूपांतर या संशोधन हैं। हालांकि, कई और विविधताएं हैं (कम से कम 25) जो मौजूद हैं और विशिष्ट समस्याओं को हल करने के लिए उपयोग की जाती हैं। उन सभी के अलग-अलग नाम हैं जैसे असेंबली पीसीआर, हॉट-स्टार्ट पीसीआर, मल्टीप्लेक्स पीसीआर, सॉलिड-फेज पीसीआर और कई अन्य।

दवा, जीव विज्ञान में किसी भी अन्य प्रश्न का उत्तर देने में मदद करने के लिए पीसीआर को संशोधित किए जाने की संभावना है। और अध्ययन के अन्य क्षेत्रों।